鴨胚胎肝間質細胞永生化?細胞培養(yǎng)步驟
間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于早期中胚層的一類多能干細胞, 在體內具有分布廣泛, 體外能夠大量擴增和免疫原性低等特點, 是一種細胞治療的理想種子細胞。自20世紀60年代，F(xiàn)riedenstein等發(fā)現(xiàn)在人骨髓長期培養(yǎng)中, 存在一種形態(tài)類似成纖維細胞的貼壁生長的細胞且移植到小鼠體內具有成骨能力和造血支持作用, 將這種細胞命名為骨髓基質細胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)。到20世紀90年代末, 人們才成功分離一種具有成骨、成軟骨和成脂肪能力的細胞, 稱之為間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)。
隨后研究者也從其他組織, 如脂肪、臍帶、胎盤、肝臟、骨實質和肌肉等中成功分離獲得間充質干細胞。作為一類成體干細胞中的間充質干細胞, 目前大部分的研究集中在人及大鼠、小鼠這兩種模式動物上, 其他動物的間充質干細胞報道相對較少。選取中國*家禽品種鴨子為實驗材料, 以鴨胚胎肝臟中的間充質干細胞為研究對象, 對其進行分離培養(yǎng)鑒定, 進行增殖能力檢測及分化能力鑒定, 為家禽干細胞研究及畜禽遺傳資源保存提供借鑒及參考。鴨胚胎肝間質細胞進行慢病毒轉染8-12h，連續(xù)傳13代，采用高濃度含嘌呤霉素培養(yǎng)基（4μg/mL）培養(yǎng)，篩選陽性克??；篩選出陽性永生化鴨胚胎肝間質細胞。
鴨胚胎肝間質細胞永生化細胞培養(yǎng)步驟
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1)準備鴨胚胎肝臟間充質干細胞*培養(yǎng)基（dmem 高糖和F12培養(yǎng)基1：1搭配，10%血清 ，1%雙抗以及1％自己配置的間質細胞因子。）。
2)培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。
二．細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4-5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，補加培養(yǎng)基至6ml。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2ml*培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細胞懸液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
